柱色谱

1. 柱色谱原理

柱色谱分离法是在色谱柱中完成的，其中主要涉及吸附剂、洗脱剂及待分混合物。

待分混合物从柱顶加入装有吸附剂的色谱柱中，然后连续不断的向下加入洗脱溶剂，待分混合物中的各化合物由于分子结构不同，他们在吸附剂和洗脱剂中的分配系数大小不同，随着洗脱剂的不断下移，吸附能力小的化合物下移速度快，而吸附能力大的化合物下移速度慢，如果柱子足够长的话，混合物中的各组分在柱内即可被分离开来，通过分别接收不同的洗脱液，然后蒸馏除去洗脱液，即可获得各种不同的纯组分。

⑴吸附剂

供柱层析法用的固体吸附剂按与极性化合物发生结合作用的能力递增次序有：纸、纤维素、淀粉、糖类、硅酸镁、硫酸钙、硅胶、氧化镁、氧化铝和活性炭等，硅胶和氧化铝是常用的两种。

硅胶（200~400目）对大多数化合物来说相对比较温和，可广泛用于烃、醇、酮、酯、羧酸、偶氮化合物和胺等的分离。

氧化铝分为：酸性Al2O3（pH=4），适于分离羧酸、氨基酸等酸性物质；碱性Al2O3（pH=10），适用于分离胺类物质；中性Al2O3，适于分离中性物质。

硅胶和氧化铝的强度或分离能力在很大程度上取决于其中所存在的水。水能非常紧密地与这两种吸附剂结合，占去了颗粒上的一些部位，这些部位本来是可以供吸附有机物的，若向吸附剂里加进水，可认为吸附剂失活了，无水硅胶或氧化铝是高活化的。但通常要避免使用高活化的吸附剂，因其会使待分离化合物发生某些形式的破坏作用和分解作用，如发生分子重排反应等。

⑵洗脱剂与被洗脱物的关系

①常用洗脱剂对极性官能团的“溶剂能力”和极性递增次序如下：石油醚、环己烷、四氯化碳、苯、二氯甲烷、氯仿、乙醚、乙酸乙酯、吡啶、丙酮、乙醇、甲醇、水、乙酸。

②各种化合物被洗脱的次序：烷烃、烯烃、醚、卤烃、芳烃、酮、醛、酯、醇、胺、酰胺、（酸和强碱）。烃可用非极性溶剂洗脱，而酸和强碱必须用极性溶剂才能洗脱。

⑶洗脱规律 

有时可以找到一种单一溶剂，用它可以分离一个混合物中的所有组分。

有时则可以找到一种能使分离得以实现的混合溶剂。

更经常的是：必须先用一种非极性溶剂开始洗脱，把相对非极性的化合物从柱中除去，然后逐渐增大熔剂的极性以促进极性较大的化合物从柱中流出或洗脱。

一般说，非极性化合物从柱中通过得最快，极性化合物通过的较慢。

分子量也是一个决定洗脱次序的因素，高分子量的非极性化合物也可能比低分子量的极性化合物通过得慢，甚至可能被某些极性化合物所超过。

使用硅胶和氧化铝时，要避免使用酸性、碱性和高活性形式的溶剂。例如：丙酮可以与任何一个这样的吸附剂通过羟醛缩合作用二聚成乙酰丙酮。当用乙酸乙酯或醇类作洗脱剂时，会使酯类的混合物发生酯交换作用。更活泼的溶剂（吡啶、甲醇和乙酸）会溶解和洗脱一部分吸附剂本身，一般情况下应避免使用洗脱液系列中极性超过乙醚或氯仿的溶剂。

洗脱时，溶剂极性的增大应逐渐进行，如果不这样做，柱内填充料往往会出现裂缝，裂缝的出现是由于吸附剂与溶剂混合时发热所致。

溶剂+吸附剂 = 溶剂·吸附剂+热

突然注入较大极性的溶剂，往往能在局部生成足能使溶剂蒸发的热量。蒸汽的产生造成了气泡，气泡可把柱内的填料挤开而形成裂缝，裂缝会使分离效果下降。

⑷柱的尺寸和吸附剂量

经验规律是：吸附剂的重量是待分物料的30~40倍。柱子的高度和直径比应大约为8:1。

某些典型样品量适用的柱尺寸和吸附剂量如下：

应注意的是，柱的尺寸和长度以及需用的吸附剂的数量，都决定于分离的困难程度，不易分离的化合物可能需要使用比经验规律更长的柱和更多的吸附剂。

⑸洗脱剂流速

一般说，需分离的混合物在柱上停留的时间越长，其在固液相的平衡越好，结果可能会使较为相似的化合物最终得以分离。但流速过慢，溶质在溶剂中的扩散速度可能变得大于下行速度，这种情况下，谱带会变宽分离效果反而会下降。

柱色谱示意图见图2.6-3。

图2.6-3  柱色谱示意图

2. 柱色谱操作

⑴装柱

下带活塞的色谱柱，活塞处不要涂太多的活塞脂，以防溶入洗脱剂中。不带砂芯的层析柱，要先向柱底加入少许洗净烘干的长度适当的玻璃毛(或脱脂棉)，用长玻璃管从柱顶将其压平，然后加入洗净烘干的白沙1cm左右厚度，表面要平整。

从柱顶沿内壁缓缓注入洗脱液中极性最小的一种溶剂至柱高的一半左右，在烧杯或锥形瓶中先加入一定量的该溶剂，然后加入吸附剂，旋摇至稠厚但易流动的浆液状，打开柱下活塞使柱内溶剂慢慢滴入接收瓶，将浆液从柱顶倒入柱中，吸附剂慢慢下沉进行均匀填料，用接收液清洗未倒完的吸附剂，倒入柱内，注意柱内液面应始终高于填料顶部，填料高度约为柱高的3/4，表面平整。

⑵加料

通过排液使溶剂水平面稍低于吸附剂顶部，用吸滴管将待分混合液或溶液（用极少量大极性可溶固体混合物的溶剂溶解所得的溶液）均匀的加于吸附剂顶部，排液，使待分液全部吸附在吸附剂顶部，用少许溶剂冲洗顶部，排液，至顶部溶剂中无扩散的待分物，此时可得一尽可能窄的加料层。压沙约1cm，加溶剂至沙层以上，在洗脱之前让样品在柱顶停留一段时间，以建立一个真正的平衡，往往可得较好的分离效果。

⑶洗脱

通过滴液漏斗从柱顶加入洗脱溶剂，排液速度1滴／秒左右，先将组分中非极性或小极性物质洗脱下来，再给洗脱液中加入极性较大溶剂，加入量由小到大，如：1%、2%、5%、10%、20%…100%。使柱中待分物中的物质按极性由小到大的次序依次被洗脱出来。

⑷纯品的获得

分别蒸去分段收集组分中的溶剂，即可得到各种化合物的粗品，粗品经重结晶后才有可能获得各种化合物的纯品。